Em se tratando de mudas certificadas de framboeseira, essas podem ser produzidas a partir de segmentos de raiz, enraizamento de estacas e cultura in vitro de tecidos (ALARCÓN, 2004), devendo-se, sempre, utilizar material genético indexado e caracterizado geneticamente, e substrato isento de patógenos e de propágulos de plantas daninhas.
A propagação por segmentos de raiz é um método rápido e de baixo custo, por meio do qual raízes de diâmetro aproximado de um lápis e comprimento de 8 cm a 10 cm são plantadas, inicialmente, em canteiros contendo areia esterilizada. Após o desenvolvimento da parte aérea são transplantadas em sacolas plásticas contendo substrato para completar a formação das mudas (UNIVERSITY OF GEORGIA, 2006).
A propagação por estacas herbáceas também pode ser utilizada. Nos meses de maio a julho, podem-se enraizar estacas herbáceas de 15 cm a 20 cm em local sombreado, completando-se a formação das mudas em recipientes maiores que contenham substrato (RASEIRA et al., 2004). Silva et al. (2012) tiveram melhores resultados com estacas caulinares do que com radiculares, não tendo ocorrido a necessidade de utilização de tratamento com ácido indolbutírico (AIB), sendo o processo de mergulhia superior ao de alporquia.
A micropropagação de framboeseira in vitro por meio de cultura de tecidos vem sendo realizada comercialmente em larga escala na Itália e nos Estados Unidos há bastante tempo (DEBNATH, 2003). Essa técnica é empregada com sucesso na propagação de diversas fruteiras, em função de possibilitar a produção massal de mudas sadias a partir de um pequeno volume de material genético, em curto período de tempo e pequeno espaço físico (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998).
Na literatura internacional, existem vários trabalhos sobre propagação in vitro de framboeseira (VERTESY, 1979; ANDERSON, 1980; PYOTT; CONVERSE, 1981; WELANDER, 1987; SOBCZYKIEWICZ, 1992; GONZALES et al., 2000; DEBNATH, 2003; DEBNATH, 2004; dentre outros). Há 18 anos, a Embrapa Clima Temperado iniciou uma série de atividades de pesquisa relacionadas à produção de mudas de framboeseira por meio de cultura de tecidos, as quais foram intensificadas nos últimos anos, em função do aumento da demanda por mudas. Anualmente, vários técnicos de laboratório de empresas públicas e privadas de micropropagação são treinados na Embrapa Clima Temperado, com o intuito de fomentar a produção de mudas por meio dessa metodologia. Dessa forma, tem-se obtido mudas de alta qualidade de várias cultivares, para disponibilização ao setor produtivo de diferentes estados brasileiros e para outros centros de pesquisa.
Com base em recentes resultados de pesquisa obtidos na Embrapa Clima Temperado, as etapas otimizadas de um sistema para produção de mudas de framboeseira por cultura de tecidos são descritas a seguir:
Pré-tratamento das plantas
Antes da coleta dos explantes, as plantas matrizes devem ser tratadas com soluções fungicida e bactericida, quinzenalmente, por pelo menos três vezes, para a minimização das contaminações durante o cultivo in vitro.
Época de coleta
As brotações devem ser coletadas nos períodos de desenvolvimento vegetativo intenso das plantas matrizes.
Fontes de explante
Devem-se utilizar explantes provenientes de plantas básicas ou matrizes adequadamente caracterizadas e indexadas.
Termoterapia
A termoterapia é um procedimento prévio à cultura de meristemas, que aumenta a probabilidade de obtenção de explantes livres de vírus. Torna-se necessária quando não se dispõe de plantas matrizes indexadas das cultivares desejadas.
Para a termoterapia, utilizam-se, geralmente, plantas de 5 cm a 10 cm de altura desenvolvidas em sacolas plásticas contendo substrato. Essas plantas podem ser obtidas a partir de brotação de raízes removidas de plantas-mãe no período de inverno.
O tratamento térmico deve ser realizado cultivando-se as plantas doadoras de explantes em câmara incubadora à temperatura de 37-39 ºC, com fotoperíodo de 16 horas de luz de intensidade próxima a 20.000 lux, por cinco a oito semanas.
Indexação
A avaliação do êxito do processo de remoção dos vírus de framboeseira por meio de termoterapia e cultivo de meristemas pode ser feita mediante indexagem biológica com plantas indicadoras por enxertia ou inoculação mecânica; testes sorológicos (ELISA), quando existe disponibilidade de antissoros; e moleculares (RT-PCR), nos casos em que se conheça as sequências do genoma viral para embasar a síntese de iniciadores.
Em se tratando da indexagem biológica, os resultados podem ser observados de quatro a seis semanas nas seguintes combinações vírus/fitoplasma e planta indicadora: complexo Raspberry Common Mosaic Virus (vírus do mosaico comum da framboesa) e Rubus occidentalis; Black Raspberry Necrosis Virus (vírus da necrose da framboesa preta) e Rubus occidentalis; Raspberry Leaf Mottle Virus (vírus do mosqueado da framboesa) e Rubus idaeus ‘Malling Landmark’ ou R. occidentalis; Raspberry Leaf Spot Virus (vírus da mancha foliar da framboesa) e Rubus idaeus‘Norfolk Giant’, ‘Baumforth’s Seedling B’ ou ‘Klon Bonn’; e Raspberry Bushy Dwarf Virus (vírus do nanismo arbustivo da framboesa) e Rubus idaeus ‘Norfolk Giant’. Após 12 meses, podem ser observados os resultados da indexagem de Rubus Stunt Phytoplasma (fitoplasma do nanismo em Rubus) em Rubus idaeus ‘Norfolk Giant’ ou ‘Zeva2’, e em 6 a 8 semanas do vírus Raspberry Vein Chlorosis (vírus da clorose das nervuras de framboesa) em Rubus idaeus ‘Baumforth’s Seedling B’.
Plantas de framboeseira também podem ser indexadas em relação ao Black Raspberry Necrosis Virus (vírus da necrose da framboesa preta) e Raspberry Bushy Dwarf Virus (vírus do nanismo arbustivo da framboesa) por transmissão mecânica, utilizando-se a planta indicadora Chenopodium quinoa.
Martin (2004) atualizou procedimentos sorológicos, moleculares e biológicos para a detecção de viroses e fitoplasmas em framboeseira. No entanto, o diagnóstico ainda se apoia substancialmente na indexagem biológica. Na última década, aumentou substancialmente o conhecimento sobre vírus de Rubus spp. Novas espécies de vírus foram descritas e reconhecidas, e estabeleceu-se, solidamente em bases moleculares e sorológicas, o diagnóstico de um grande número de agentes patogênicos virais.
Tamanho dos explantes
Em média, os explantes devem ser coletados com 1,5 cm de comprimento, correspondendo aos ponteiros das plantas. Em seguida, devem ser acondicionados em papel toalha umedecido ou em béquer contendo água destilada e esterilizada, sempre ao abrigo da luz. As cultivares devem ser adequadamente identificadas.
Desinfestação dos explantes
Esta etapa deve ser realizada em laboratório. Inicialmente, os explantes devem ser lavados em água corrente. Em seguida, devem ser desinfestados, mergulhando-os completamente em soluções à base de álcool 70%, por 15 segundos, e de hipoclorito de sódio 1%, por 10 minutos. Finalmente, sob condições assépticas, no interior de câmara de fluxo laminar, deve-se proceder à lavagem dos explantes com água destilada autoclavada, por três vezes, para a completa remoção dos resíduos de cloro.
Extração de meristemas
A cultura de meristemas é realizada para otimizar a eliminação de viroses, viroides e micoplasmas durante a cultura in vitro de tecidos, fundamentando-se no fato de que o tecido meristemático é praticamente livre desses patógenos, principalmente em plantas de crescimento rápido.
A extração dos meristemas deve ser realizada no interior de câmara de fluxo laminar, com auxílio de pinça e bisturi, utilizando lupa estereoscópica. Os meristemas extraídos devem apresentar tamanho próximo a 0,1 mm, podendo-se utilizar explantes maiores no caso do material vegetal ser proveniente de plantas básicas ou matrizes. Explantes menores são muito difíceis de serem extraídos e apresentam baixa porcentagem de pegamento. Explantes maiores aumentam os riscos de contaminação por fungos e bactérias. Após a extração, os meristemas devem ser introduzidos em meio de cultura o mais rápido possível, para se minimizar os riscos de contaminação e dessecamento.
Estabelecimento in vitro
Meio de cultura
Macronutrientes e micronutrientes do meio MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) suplementado com 1 mg L-1 de BAP (6-benzilaminopurina), 0,01 mg L-1 de ANA (ácido naftalenoacético) e 0,1 mg L-1 de AG3 (ácido giberélico), acrescido com 0,5 mg L-1 de tiamina, 0,5 mg L-1 de piridoxina, 0,5 mg L-1 de ácido nicotínico, 2 mg L-1 de glicina, 30 g L-1 de sacarose, 100 mg L-1 de myo-inositol e 7 g L-1 de ágar. O pH do meio de cultura deve ser ajustado para 5,8 antes da autoclavagem. A composição do meio MS é descrita na Tabela 1.
Tipos de frasco
A introdução in vitro dos explantes deve ser feita em recipientes individuais, pois o risco de contaminação nessa fase é bastante elevado. Recomenda-se utilizar tubos de ensaio de 15 mm de diâmetro por 150 mm de altura, contendo 6 mL de meio de cultura.
Condições de autoclavagem
São as seguintes: 121 °C, a 1,5 atm, por 15 minutos.
Duração do cultivo
Quarenta dias
Condições de cultura
Cultivo no escuro, nas primeiras 48 horas, para minimizar a oxidação dos explantes. Nos 38 dias restantes do subcultivo, recomenda-se utilizar intensidade luminosa de 20 µE m-² s-¹, temperatura de 25 ºC ± 2 ºC e fotoperíodo de 16 horas.
Multiplicação
Meio de cultura
Macronutrientes, micronutrientes e vitaminas do meio MS suplementado com 0,8 mg L-1 de BAP, 15 mg L-1 de sulfato de ferro, 30 g L-1 de sacarose e 7 g L-1 de ágar. O pH do meio de cultura deve ser ajustado para 5,8 antes da autoclavagem.
Tipos de frasco
Vários tamanhos e formatos de frasco de vidro ou de plástico podem ser utilizados. Um dos tamanhos recomendados é o de 60 mm de diâmetro por 140 mm de altura. Deve-se buscar equilíbrio em relação ao tamanho do frasco, sabendo-se que os frascos maiores comportam maior número de plântulas, sendo mais econômicos; porém, apresentam maior risco de contaminação. A quantidade de meio de cultura por frasco varia em função de seu tamanho. No frasco recomendado, deve-se utilizar 40 mL de meio de cultura.
Condições de autoclavagem
São as seguintes: 121 °C, a 1,5 atm, por 15 minutos.
Condições de cultura
Cultivo sob intensidade luminosa de 20 µE m-² s-¹, temperatura de 25 ºC ± 2 ºC e fotoperíodo de 16 horas.
Tipo e tamanho dos explantes
A repicagem deve proporcionar explantes com tamanho de 2 mm a 3 mm, contendo de duas a três gemas.
Número de subcultivos
Recomenda-se a realização de seis subculturas de 25-30 dias (cada uma), embora normalmente não sejam relatados variantes somaclonais em framboeseira (HOEPFNERET et al., 1996).
Sistemas alternativos
Com a finalidade de reduzir custos durante a fase de cultivo in vitro, alguns autores recomendam o uso parcial ou total de iluminação natural na sala de cultivo (KODYM; ZAPATA-ARIAS, 1999), a substituição da sacarose por açúcar cristal e do ágar por amido de batata ou de milho (KODYM; ZAPATA-ARIAS, 2001). Erig e Schuch (2005) sugerem o uso de luz verde, proporcionada por filtros coloridos de acetato celulose, em substituição à luz branca proporcionada pelas lâmpadas fluorescentes brancas-frias, para aumentar a taxa de multiplicação dos explantes.
Eficiência do sistema
Espera-se obter por volta de 750 plântulas por meristema após seis subcultivos de 25-30 dias.
Enraizamento in vitro
Meio de cultura
Metade da concentração de sais do meio MS, micronutrientes e vitaminas do MS, suplementado com 0,1 mg L-1 ANA, 30 g L-1 de sacarose e 7 g L-1 de ágar, sem adição de reguladores de crescimento, sendo o pH do meio de cultura ajustado para 5,8, antes da autoclavagem.
Tipos de frasco, condições de autoclavagem e de cultura
Idem ao item `Multiplicação in vitro`.
Tipo e tamanho dos explantes
A repicagem deve ser conduzida de forma a proporcionar a individualização das plântulas, que serão dispostas no meio de cultura para alongar e emitir raízes. O tamanho mínimo dos explantes para essa fase é de 1 cm de altura.
Qualidade esperada
Plântulas adequadamente alongadas e enraizadas com altura maior do que 2 cm, raízes curtas e abundantes, após 25 dias de cultivo.
Eficiência do sistema
Nas condições descritas, pode-se obter quase 100% de plântulas enraizadas.
Transplantio em casa de vegetação
Terminada a fase de enraizamento in vitro, as plântulas devem ser removidas dos frascos, lavadas e, cuidadosamente separadas umas das outras. Em seguida, devem ser classificadas por tamanho e transplantadas para recipientes, contendo substrato com características químicas e físicas favoráveis ao desenvolvimento das plantas. Bandejas plásticas ou de isopor, ou ainda saquinhos de polietileno de diferentes tamanhos podem ser utilizados como recipientes. O substrato deve ser isento de patógenos e de propágulos de plantas daninhas, podendo ser adquirido de empresas especializadas ou produzido no próprio viveiro, a partir de casca de arroz carbonizada, casca de pinos, serragem, vermiculita, perlita, turfa, dentre outros materiais.
As mudas em formação devem ser dispostas sobre bancadas de, no mínimo, 30 cm de altura em relação ao solo, sendo mantidas em ambiente protegido. Recomenda-se que o local seja coberto com filme de polietileno transparente ou outro material, para evitar a entrada de água das chuvas, e que possua lateral revestida com tela antiafídica, para impedir a entrada de vetores de doenças.
Aclimatização
A passagem das plantas do ambiente in vitro, que apresenta alta umidade relativa do ar, completa assepsia e iluminação, temperatura e fotoperíodo controlados, para a condição ex vitro deve ser gradual. Isso é conseguido por meio da disposição das plantas no interior de um túnel plástico, com luminosidade, temperatura (20-28 oC) e irrigação controladas, simulando a condição do laboratório. Em seguida, deve-se proceder à remoção gradual do plástico, de forma a permitir que as plantas passem do estado heterotrófico, no qual dependiam de um suprimento externo de energia, no caso a sacarose, para o estado autotrófico, em que se faz necessária a realização de fotossíntese para sobreviver (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1990).
As plântulas de framboeseira são de fácil aclimatização, quando comparadas às de outras espécies frutíferas. Por isso, pode-se obter uma porcentagem de pegamento de 85% a 90%.
Formação das mudas
Nutrição
Durante e após a fase de aclimatização, as mudas devem ser fertilizadas, semanalmente, com solução nutritiva composta por nitrogênio, fósforo e potássio (fórmula 10:10:10).
Irrigação
Deve ser realizada diariamente, em função da necessidade das plantas e da umidade no substrato.
Controle de pragas
Deve ser preventivo, por meio do uso de fungicidas, inseticidas e acaricidas.
Padrão de comercialização
Em média, nas condições citadas, as mudas tornam-se aptas ao transplantio no campo a partir de 90 dias do início da aclimatização, quando apresentam tamanho mínimo de 10 cm. As mudas certificadas têm tolerância zero para mistura varietal, plantas atípicas e presença de patógenos da cultura.
Eficiência do sistema
O sistema de produção de mudas de framboeseira in vitro por cultura de tecidos descritos é bastante eficiente. Embora possa ser utilizado para todas as cultivares de framboeseira, a eficiência apresenta pequenas variações em função da cultivar (OLIVEIRA et al., 2010). Em média, obtém-se 675 mudas por explante inicial por ciclo de propagação, ou seja, em um prazo total de dez meses da extração do meristema até as mudas estarem aptas ao plantio.
Controle de qualidade
Como as plantas básicas e matrizes estão sujeitas à recontaminação e os métodos de cultura de meristemas e de termoterapia não são completamente eficientes, recomenda-se o monitoramento da presença de patógenos, ao final do processo de produção das mudas (SPIEGEL, 1998).
A indexação para viroses pode ser realizada pelo método da enxertia de tecido da muda a ser testada em espécies sensíveis. Testes sorológicos, como o ELISA, e moleculares, como a PCR, também podem ser utilizados na indexação de plantas de framboeseira.
A ocorrência de misturas de cultivares em pomares é um dos problemas da fruticultura, causando dificuldades no planejamento e na operacionalização dos tratos culturais e da colheita. Muita atenção e cuidado devem ser tomados durante o ciclo de multiplicação de mudas nos laboratórios de micropropagação, pois um único frasco fora de sua posição na sala de cultivo resultará em milhares de mudas misturadas.
Como é praticamente impossível diferenciar cultivares de framboeseira no estádio in vitro e durante a aclimatização, o monitoramento da fidelidade genética pode ser realizado por meio de marcadores morfológicos durante o desenvolvimento das mudas no pomar. Em casos especiais, podem ser utilizados marcadores moleculares, tais como o Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD), Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), Simple Sequence Repeats (SSR) e Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998).
Na Embrapa Clima Temperado, já foram produzidas milhares de mudas de framboeseira, utilizando o presente protocolo, não tendo sido identificadas plantas com características morfológicas que pudessem ser consideradas distintas do padrão original das cultivares. Evidentemente, a ausência de plantas atípicas deve ser confirmada em campo, principalmente após a frutificação, pois as mutações mais frequentes em fruteiras ocorrem na arquitetura das plantas e nas características dos frutos (ISRAELIET et al., 1991; KAUSHAL et al., 2004). O fato de o sistema de propagação proposto não passar pela fase de calo, utilizar baixas doses de reguladores de crescimento e, principalmente, número reduzido de subcultivos, contribui para a minimização do surgimento de variantes somaclonais (SWARTZ et al., 1981; OLIVEIRA et al., 2000; KAUSHAL et al., 2004).
Análise de viabilidade econômica
As cultivares de framboeseira são bastante responsivas in vitro, apresentando taxas de multiplicação superiores às de outras espécies frutíferas, tais como as da bananeira e do abacaxizeiro, para as quais também existem empresas de produção de mudas micropropagadas estabelecidas no mercado. Em média, independentemente da cultivar, utilizando o presente protocolo são obtidas taxas de multiplicação próximas a 5,0 após o terceiro subcultivo.
Basicamente, para produzir mudas por meio de cultura in vitro de tecidos é necessário infraestrutura física para o laboratório e casas de vegetação, equipamentos, vidraria, reagentes e mão de obra treinada. Esta última representa de 40% a 70% do custo de produção (OLIVEIRA, 1998).
O custo de produção das mudas micropropagadas é variável em função da escala de produção, do nível tecnológico empregado, da remuneração local paga à mão de obra, da distância do laboratório aos centros fornecedores de insumos e equipamentos, da qualidade das estruturas do laboratório e da casa de vegetação e das estratégias utilizadas para a minimização de despesas, tais como iluminação natural, uso de açúcar cristal em vez de sacarose, uso de amido de batata ou de milho no lugar de ágar, dentre outras. A instalação do laboratório na zona rural também contribui para a redução do custo de produção, pois a energia elétrica é subsidiada e a mão de obra normalmente menos onerosa.
Como vários fatores estão envolvidos, o custo de produção da muda apresenta uma grande variação. Em termos médios, considerando-se um laboratório com capacidade de produção de 100 mil mudas de framboeseira por ano, nas condições do Estado do Rio Grande do Sul, pode-se estimar um custo de produção de aproximadamente R$ 2,50 a R$ 3,00 por muda. Atualmente, as mudas de framboeseira estão sendo vendidas entre R$ 3,00 e R$ 4,00 cada, havendo muita procura em função, principalmente, do preço da fruta no mercado. Desta forma, a atividade apresenta-se como uma oportunidade atraente de investimento. Nesse aspecto, recomenda-se que o viveirista também utilize a estrutura do laboratório para a produção de mudas e matrizes de outras espécies, tais como abacaxizeiro, amoreira-preta, bananeira, batata, flores, mirtilo, dentre outras, visando maximizar o uso dos meios de produção e aumentar a competitividade.
Como fazer mudas de Framboesa
Nome científico: Rubus idaeus
Origem: centro norte da Europa, Ásia.
Família: Rosáceas.
Características gerais:
– A framboesa é uma planta arbustiva, cujos ramos espinhosos formam grandes moitas.
– Os frutos granulosos, semelhantes a amoras, delicados, suculentos, de sabor levemente ácido. Ocorrem nas extremidades dos ramos, numa coloração que varia do amarelo ao negro, passando pelo vermelho, ricos em vitamina C.
– A planta se torna mais produtiva em áreas de verão ameno, e temperaturas menores que sete graus, por mais de 250 horas, no inverno.
– Portanto, trata-se de uma planta adequada para a região sul do Brasil, e regiões montanhosas, onde o clima é propício para sua cultura e produtividade.
Propagação:
A propagação pode ser feita por estaquia de ramos maduros, e por mudas que brotam de suas raízes superficiais.
Pelo método da estaquia:
– Aproveitar a poda de inverno (hibernal), que deverá acontecer entre maio e julho de cada ano, para cortar as estacas com 15 a 20 centímetros de comprimento, que devem ser enterradas em pequenos feixes, em locais sombreados e com boa umidade.
– Depois das estacas brotadas, devem ser arrancadas e levadas para seus locais definitivos.
– Plantar as estacas a uma distância aproximada de 30 centímetros uma da outra, embaixo da linha da espaldeira.
– As plantinhas deverão receber tutores de bambus ou, qualquer outro material disponível, onde serão amarradas para serem conduzidas até o topo da espaldeira.
Espaldeira:
– A espaldeira funcionará como suporte das plantas e deverá ser construída da forma mais simples possível: Dois mourões (palanques) que deverão ser fincados, um em cada extremidade da espaldeira, em seguida, colocar um fio de arame liso bem esticado, ligando um mourão ao outro, a uma altura de 1,20 metros, do solo.
– Os tutores deverão ser fincados no chão junto à cova da nova planta, cuja extremidade superior deverá ser amarrada, fixando-a ao fio de arme.
– Distancia entre as espaldeiras: aproximadamente 3,0 metros.
Solo:
– Na época da plantação das estacas brotadas, em seus locais definitivos, aplicar três litros de esterco animal bem curtido junto com 40 gramas de superfosfato simples, em cada cova.
– A framboeseira pode ser plantada em terrenos planos ou encostas, bem drenados.
– Adapta-se perfeitamente a solos de textura média, ricos em matéria orgânica e com pH variando entre 5,0 a 5,5.
– Níveis pluviométricos em torno de 700 a 900 milímetros.
Produção:
A frutificação ocorrerá depois de um ano e meio após as mudas transplantadas em seus locais definitivos.
Utilização:
O fruto poderá ser ingerido in natura ou na produção de geléias caseiras.
Na industrialização, transformados em polpa congelada, sucos, iogurtes, sorvetes, gelatinas, etc.
Tratos culturais:
– Deverá processar a poda após o período de produção.
– Desbastar a planta retirando todos os galhos que produziram frutos.
– Conduzir a nova brotação até o fio de arame, com novos tutores, pois a próxima colheita será produzida nesses novos rebentos formados durante o ano.
– Após a poda fazer nova adubação de cobertura com 3 litros por planta, de esterco animal bem curtido, misturado ao adubo superfosfato simples.
